乙型肝炎病毒感染导致的肝炎，发展为慢性肝炎、肝炎后肝硬化、肝细胞性肝癌。新一代核苷类抗病毒药物，如拉咪呋定、法昔洛韦等治疗HBV感染，日益受到重视，它可以插入新的病毒DNA链中，抑制HBVDNA聚合酶的活性，从而阻止了HBVDNA的合成，使得HBV DNA转阴。但是，在治疗过程中，部分病人出现血清HBVDNA聚合酶基因区的保守序列YMDD(络氨酸一蛋氨酸一天冬氨酸一天冬氨酸)基因变异，其中最常见编码蛋氨酸的552位点出现了核苷酸的替代，目前已经报道的主要有两种常见的变异形式即M552V、M5521对治疗产生了耐药。为了建立一种快速，简便，经济，特异的检测HBVDNA变异的方法，研究拉咪呋定治疗过程中出现的HBV基因变异的问题，我们利用限制性片断长度多态性分析方法作了如下研究。
材料与方法
1.研究对象：240例拉咪呋定(100mR/日口服)治疗的慢性乙型肝炎病人血清标本，收集自北京佑安医院门诊及住院病人。
2.方法：设计错配引物应用巢式PCRRFLP方法扩增HBVDNA，由于YMDD基因区没有任何酶切位点，在引物设计中引人Nde I和NLaⅢ酶切位点，参照Mrchelle的方法。
3.HBV DNA纯化：采用常规蛋白酶K消化，酚抽提的方法。
4.HBV DNA外引物扩增位点：50ul反应体积中含有10 XPCR缓冲液5ul，P1，R1引物各0.5ul，dNTP各200mM，Taq酶2u，模板20ul，循环反应条件94~C，5min；94℃，45s；55~C，45s；72℃，45s；共35个循环72~C，7rain延伸。扩增552位点：PCR循环加入F2、R2引物各0.5ul，其它条件与以上相同。扩增528位点：取第一次PCR产物10ul，F3，R2引物各0.5ul，余条件与以上相同。分别取552、528位点扩增产物lOul，2%琼脂糖凝胶电泳后，紫外透射分析仪观察结果。HBV DNAPCR阳性的产物进行酶切分析。
5.限制性内切酶分析：10ul酶切反应体系中含有Ndel2ul，(或NLaⅢ)酶切缓冲液2ul，产物6ul；37消化1小时。紫外透射分析观察结果。
6.HBVDNA定量PCR测定：AG9600定量基因扩增仪，HBVDNA定量PCR检测试剂(AcuGenHBVQuantitativeTest)美国Biotronics公司提供，按操作说明书规定进行操作，HBV DNA水平用每m1血清HBV DNA模板起始拷贝数表示，测定的临界值为1X104。
7.HBV克隆测序：三例PCR扩增阳性产物(RLFP方法分析为野毒株一例、M552V伴L528M变异1例、M5521变异1例)经低熔点琼脂糖纯化后，在连接酶作用下与载体PGEM—T Vector(美国Promega公司)在16''12水浴连接过夜，转化Top大肠杆菌。在IPTG和X—gal存在的条件下，挑取含有目的基因片断的白斑，用PCR方法鉴定阳性克隆后，进行基因测序分析。
结 果
一、YMDD变异测定结果
240例拉咪呋定治疗的慢性乙型肝炎病人血清测定HBVDNAYMDD，其中51例发生变异。
1.552位点变异(用PCR—RFLP方法，引物F2、R2扩增产物经酶切分析)：在拉咪呋定治疗中HBVD-NA聚合酶YMDD位点产生了变异，使得HBV DNA的原靶序列ATG发生了变化，引入的NdeI酶切位点缺失，从而产生119bp的变异株条带；在野毒株中引入的酶切位点存在并可以被酶消化切开，所以产生了99bb和20bp个的两个片段，20bp的小片段与引物带参杂在一起。
2.M552V变异：在确定了是YMDD变异后进一步分析是M552V、M5521变异，可以用NlaⅢ酶切，M552V变异，能够被此酶切开，DNA片段成为95bp和24bp的两个片段。
3.528位点变异：除了YMDD变异以外，还存在DNA聚合酶B区528位点的变异，它是由528位亮氨 酸被蛋氨酸取代(1528M，用引物F3，R2扩增，产物是197bp，引入NLaⅢ酶切位点，如果是L552M变异，可以将其切开，形成176和22bp大小两个片段。
4.拉咪呋定治疗240例慢性乙型肝炎患者血清HBVDNA变异的情况：240例拉咪呋定治疗的慢性乙型肝炎患者52—78周，发生血清HBVDNA变异的共51例，其中M552V变异38例，M5521变异13例L528M变异27例；M522V变异同时有L528M变异的有26例，M5521变异同时有L528M变异的1例。在552位点单一基因变异的只有24例。
二、HBV DNA定量分析与YMDD变异的关系
慢性乙型肝炎病人服用拉咪呋定后HBADNA迅速下降到检测水平以下，当发生耐药基因突变时HBVDNA反跳240例患者中51例发生YMDD变异，患者血清HBV DNA定量分析与HBV DNA变异的比较
见表1。
表1 HBV DNA定量分析与YMD变异的关系
TablThecorrelationbetweetheHBV DNA QuantitativePCRassayand''hemutationOfYMDD51例患者血清HBVDAN变异，DNA水平升高，但是70.58%患者(36/51)其DNA水平仍在1X105以下，高水平复制HBV DNA≥1X 108为13.72%(7/51)。HBVDNA测序法比较：用DNA序列分析检测验证RFLP方法是否可行，对三例标本进行了测序，2例检出YMDD变异，(其中1例为YVDD，伴有L528M变异，1例为YIDD变异)l例是野毒株(见表2)。
表2 3例患者核耷酸序列测定编码的HBVP基因区氨基酸序列
Table 2 HBV P gene range aminO acids sequence in 3 patients
FRKTPMGVGLSPFLLAQFTS AECSVVRRAFPHCLAFSYM D DVVLGAKSVQHL
三、ALT水平变化与YMDD变异的关系
51例发生YHDD变异的患者在治疗52周-78周时34例ALT上水平明显高于无变异患者组(52周76.7+27.9L匕27.9+10.1，P：0.001；78周66.7+57.6L匕27，3+21.2，P：0.001)，治疗52周时，23例变异的患者中16例ALT升高，2例病人高于治疗前水平，伴血清胆红素升高，因而再次住院治疗。治疗78周时，28例变异患者中18例ALT升高，不论HBVDNA变
